Mengenal DNA Plasmid Pada Bakteri
Pengertian Plasmid Pada Bakteri
Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal pada bakteri (dan beberapa jenis yeast). Umumnya plasmid berukuran kecil dan berbentuk sirkuler (Gambar 1). DNA pada plasmid mampu direplikasi sendiri (autonomous replication). Jumlah dan ukuran plasmid dalam sel bakteri bervariasi tergantung jenis bakteri yang memiliki plasmid tersebut.
Umumnya gen yang terdapat dalam plasmid bukan gen-gen yang esensial bagi pertumbuhan bakteri atau mikroorganisme pemiliknya. Contoh gen yang terdapat dalam plasmid adalah gen-gen resistensi terhadap antibiotik, dan ada pula plasmid F, yakni plasmid yang bertanggung jawab terhadap kemampuan sel melakukan konjugasi.
Berapa plasmid memiliki multicloning site, yakni area dengan banyak urutan basa yang mampu dikenali oleh enzim restriksi, hingga bermanfaat dalam dunia bioteknologi modern, terutama dalam penelitian yang melibatkan bakteri.
Beberapa karakteristik dan pemanfaatan plasmid akan dijelaskan lebih lanjut dalam artikel Plasmid Bakteri ini.
Karakteristik Umum Plasmid Bakteri
Ukuran Plasmid lebih Kecil Dibanding Kromosom Sirkuler Utama Bakteri
Plasmid, seperti yang telah diketahui, memiliki ukuran yang lebih kecil dibandingkan kromosom bakteri. Perbandingan konkretnya adalah gambar dibawah ini.
Gambar ini menunjukkan peta dari kromosom dan plasmid dari bakteri Celeribacter indicus P73T yang diteliti oleh Cao et al. pada artikel ilmiahnya yang diterbitkan 2014 lalu.
Pada gambar ini menunjukkan bahwa jika dibanding dengan kromosom yang memiliki jumlah pasangan basa hingga 4,53 Mbp (Mega base pair), terlihat superior dibanding plasmid yang berukuran kecil. Plasmid terbesar saja, pP73A hanya memiliki sekitar 0,155 Mbp, jumlah tersebut sekitar 3% dari jumlah pasangan basa dari kromosom sirkuler bakteri tersebut.
| Gambar 2. Perbandingan ukuran Kromosom dan plasmid bakteri. Kesamaan warna menunjukkan presentase homologi pasangan basa, kadang menunjukkan fungsi dari gen-gen tertentu. |
Fungsi Plasmid dan Penamaannya
Fungsi plasmid adalah sebagai pembawa sifat non-esensial bagi pertumbuhan bakteri. Esensial disini berarti berperan secara langsung dalam metabolisme dan segala aktivitas biologis yang menyokong pertumbuhan bakteri.
Umumnya plasmid memiliki gen-gen pembawa sifat resisten terhadap antibiotik. Antibiotik sendiri, seperti yang Anda tahu, tidak selalu ada dalam lingkungan, hingga keberadaan gen-gen tersebut tidak esensial.
Fungsi plasmid juga merupakan faktor penentu nomenklatur atau penamaan plasmid.
Plasmid Ti contohnya, yang diberi nama sesuai kemampuan plasmid tersebut menginduksi tumor pada tumbuhan, membentuk crown gal sedangkan pSym adalah gen yang bertanggung jawab dalam proses pembentukan bintil akar spesies bakteri Rhizobium pada legum-leguman.
[ Note: p berarti plasmid ]
Contoh fungsi plasmid sekaligus penamaannya disajikan dalam Tabel 1 berikut.
Penamaan Berdasarkan Nama Konstruktor Peta Gen Plasmid
Penamaan plasmid yang kedua adalah berdasarkan nama konstruktor yang memaparkan fungsi-fungsi gen-gen pada plasmid tertentu.
Formulasinya adalah sebagai berikut:
p [Huruf depan nama konstruktor] [Nomor derivat dari plasmid tersebut]
Contohnya adalah plasmid pATW38 yang dikonstruksi oleh Prof. Aris T. Wahyudi, pengampu matakuliah Genetika Mikrob di Departemen Biologi IPB. Atau pBR322, sebuah plasmid derivat ke-322 dari plasmid ColE1 yang dikonstruksi oleh Bolivar dan Roddrigues.
| Gambar 3 plasmid pBR322 adalah plasmid kloning vektor yang penamaannya berdasarkan para konstruktor yang memetakan gen pada plasmid ini yakni Bolivar dan Rodriguez |
Macam-macam Struktur Plasmid Pada Mikrob
Umumnya struktur plasmid bakteri adalah sirkuler (lingkaran tertutup) double stranded. Jadi, misalnya Anda melakukan pemetaaan plasmid dari gen A, maka setelah seluruh gen berhasil Anda petakan, Anda akan menemukan kembali gen A.
Namun ada pula plasmid yang memiliki struktur linear (double stranded lurus) seperti yang ditemukan pada Streptomyces and Borrelia.
Pembentukan Supercoiling Pada Plasmid dan Purifikasi Plasmid dengan Memanfaatkan Fenomena Tersebut.
Pembentukan supercoiling bertujuan memudahkan pengepakan materi genetik dalam bentuk sirkuler seperti pada plasmid bakteri.
Supercoiling pada plasmid dapat Anda bayangkan sebagai karet gelang yang memuntir. Atau kabel telepon yang saling melilit. Akibatnya, sama dengan lilitan kabel telepon yang membuat panjang kabel tersebut berkurang, panjang DNA juga lebih kompak hingga dapat terkemas secara efisien dalam sel.
Supercoiling terbentuk akibat DNA-DNA pada plasmid terikat oleh ikatan kovalen, hingga bagian DNA sirkuler tersebut berdekatan dan memuntir. Fenomena ikatan kovalent ini disebut sebagai covalently closed circular plasmid.
Supercoiling pada plasmid tersebut dapat dibuka dengan enzim topoisomerase yang memuat potongan pada salah satu strand double helix plasmid supercoiling hingga plasmid tersebut terelaksasi dan kembali membentu DNA sirkuler biasa (Gambar 5.)
| Gambar 6 DNA supercoiling pada plasmid dan relaksasinya akibat terbentuknya nick pada salah strand dari struktur double strand DNA tersebut. (Sumber Gambar: http://bs.kaist.ac.kr) |
Tujuan relaksasi plasmid supercoiling tersebut adalah untuk memudahkan enzim DNA polimerase mereplikasi DNA plasmid yang mengalami supercoling.
[ artikel untuk bacaan lebih lanjut: DNA Topology ]
Supercoiling dan Purifikasi Plasmid
Plasmid umumnya dapat diisolasi dan dipurifikasi dengan metode gradient density menggunakan EtBr-CsCl. Prinsip utama dari metode ini adalah EtBr yang tidak mampu berikatan dengan baik pada DNA plasmid supercoiling. Akibatnya, pada saat campuran ekstraksi sampel dan EtBr disentrufugasi, DNA plasmid yang mengalami supercoiling akan terletak dibawah DNA yang linear atau sirkuler yang mengalami nick (Gambar 7.)
Perbedaan ini terjadi karena DNA plasmid yang mengalami supercoiling memiliki Buoyant density lebih tinggi dibandingkan DNA plasmid sirkuler atau nick yang banyak berikatan dengan EtBr.
Jenis-jenis Replikasi Pada Plasmid Bakteri
Replikasi Plasmid Bakteri: Replikasi Tetha (ϴ)
Replikasi DNA plasmid umumnya disebut replikasi tetha, karena saat direplikasi, plasmid mengalami penggelembungan pada suatu titik hingga nampak seperti lambang uppercase theta (ϴ) (Gambar 8.)
Proses replikasi DNA plasmid dimulai pada situs khusus pada plasmid yang disebut oriV (origin of replication, V berarti vegetative growth).
Replikasi theta plasmid dimulai dengan membukanya lilitan double strand DNA plasmid pada oriV yang dilanjutkan oleh pembuatan primer oleh RNA polimerase pada oriV tersebut. Selanjutnya, DNA polimerase III mulai menyintesis untai baru DNA plasmid.
Replikasi DNA plasmid bisa berjalan dua arah (bidirectional) dan satu arah unidirectional.
Mekanisme replikasi plasmid tersebut sebagai berikut:
Replikasi Theta Plamid Unidirectional
Pada proses replikasi plasmid unidirectional, replication fork membuka utas ganda DNA plasmid pada satu arah saja.
Proses penambahan basa berlangsung dengan arah 3′ ke 5′ oleh DNA polimerase berlangsung hingga DNA plasmid rampung direplikasi dan masing-masing copy baru dari plasmid terlepas.
Proses Replikasi Theta Plasmid Bidirectional.
Pada replikasi plasmid bidirectional, arah pembukaan replication fork berjalan dua arah berlawanan. Setelah masing-masing replication fork bertemu pada suatu titik, maka masing-masing plasmid baru memisah dan menyelesaikan proses replikasinya menjadi dua plasmid baru yang utuh.
Replikasi Plasmid: Rolling Circle Replication
Rolling circle replication berlangsung dalam dua tahap berikut:
- Replikasi secara utuh yang terjadi pada satu utas DNA plasmid induk, setelah utas tersebut lengkap direplikasi, satu utas induk lain terlepas
- Utas yang terlepas direplikasi menjadi DNA plasmid utuh secara otonom dari pasangan awalnya
Mekanisme Rolling Circle Replication
Biomolekul yang Terlibat Dalam Replikasi Rolling Circle
Molekul-molekul yang terlibat dalam proses ini antara lain:
- Rep protein: Protein yang memiliki fungsi membuka utas ganda plasmid dan menstabilkan pembukaan itu dengan mengikat asam amino tirosinnya pada ujung fosfat DNA plasmid (5′)
- DNA Pol II: Enzim yang menyintesis untai baru DNA plasmid
- Enzim ligase: Melengkapi proses sintesis DNA plasmid pada akhir tahap dua
Sedangkan mekanisme pembentukan plasmid baru dengan replikasi Rolling Circle antara lain:
- Rep mengenali area pada plasmid yang disebut sebagai Double Strand Origin (DSO) dan membuka utas ganda DNA plasmid
- Karena area DSO adalah urutan basa yang palindromik, seringkali terbentuk formasi cruciform yang mirip salib akibat perpasangan basa dari bagian inverted repeat
- Rep protein tetap menempel pada area tersebut dengan menstabilkan pembukaan. Hal ini terjadi karena asam amino tirosin pada protein Rep membentuk ikatan kovalen dengan ujung fosfat DNA plasmid (5′)
- DNA Pol III memulai replikasi dengan menambahkan basa baru dan mengikatkan gugus fosfat asam amino baru pada gugus hidroksil DNA plasmid lama yang bebas dan proses ini berlangsung hingga utas tersebut berhasil direplikasi
- Setelah DNA Pol III menyelesaikan replikasi utas tersebut, protein Rep membuat nick baru dan melepas utas tunggal DNA plasmid yang belum direplikasi. Nick yang terbentuk kemudian diligasi oleh DNA ligase dan membentuk plasmid baru yang utuh
- Pada utas yang belum direplikasi, ujung bebas utas DNA yang terlepas tersebut dibentuk DNA sirkuler baru oleh protein Rep dengan mentransfer gugus fosfat DNA yang berikatan dengan tirosin pada awal proses ini dengan gugus hidroksil pada ujung bebas utas DNA tersebut
- Pada utas tunggal sirkuler tersebut, proses replikasi dimulai dengan pembentukan primer oleh RNA polimerase dan dilanjutkan dengan DNA Pol III yang menyintesis utas baru berdasarkan basa yang menyusun utas tadi
- Setelah plasmid tersebut rampung direplikasi, primer dihilangkan oleh RNA polimerase dan terbentuklah plasmid utuh. Proses ini menghasilkan dua plasmid baru, sama dengan replikasi theta