Angka Lempeng Total (ALT/TPC): Prinsip, Prosedur, Rentang Koloni, dan Perhitungan CFU

Angka Lempeng Total (ALT), yang dalam literatur berbahasa Inggris disebut Total Plate Count (TPC) atau Aerobic Plate Count (APC), adalah metode enumerasi untuk memperkirakan jumlah mikrob aerob mesofilik hidup dalam suatu sampel. Hasilnya dilaporkan dalam CFU per gram atau CFU per mililiter, dan dipakai sebagai indikator sanitasi proses, mutu bahan baku, serta umur simpan produk.

Satu hal perlu diluruskan sejak awal. ALT tidak mengukur jumlah sel total dan tidak mengidentifikasi jenis mikrob apa pun. Sel yang mati, sel yang tertekan sehingga gagal tumbuh pada medium dan suhu yang dipakai, serta mikrob anaerob obligat maupun termofilik tidak terhitung. Karena itu ALT lebih tepat dibaca sebagai perkiraan populasi yang mampu membentuk koloni pada kondisi uji tertentu, bukan sebagai sensus mikrob dalam sampel.

Prinsip: Dari Sel Tunggal Menjadi Koloni yang Terlihat

Metode ini bersandar pada satu asumsi sederhana: setiap sel mikrob hidup yang terpisah, jika diberi nutrisi dan suhu yang sesuai, akan membelah berulang kali di satu titik tetap pada medium padat hingga membentuk massa sel yang tampak mata. Massa itulah yang disebut koloni. Dengan membalik logikanya, jumlah koloni yang tumbuh dapat dipakai untuk memperkirakan jumlah sel yang semula ditanam.

Asumsi tersebut punya kelemahan yang melekat, dan kelemahan itu yang menjelaskan satuan pelaporannya. Sel mikrob sering tidak berada dalam keadaan terpisah satu-satu. Streptokokus membentuk rantai, stafilokokus membentuk gerombol, dan sel-sel yang menempel pada partikel pangan ikut terbawa bersama-sama. Satu rantai berisi delapan sel tetap tumbuh menjadi satu koloni. Karena itu hasil tidak pernah dinyatakan sebagai “jumlah sel”, melainkan sebagai CFU (colony forming unit), yaitu unit pembentuk koloni. Satu CFU dapat berasal dari satu sel maupun dari satu gerombol sel.

Pengenceran Bertingkat dan Alasan Keberadaannya

Sampel pangan atau air sering mengandung populasi mikrob yang terlalu padat untuk dihitung langsung. Jika seluruh sampel ditanam apa adanya, koloni akan tumbuh bertumpuk dan menyatu sehingga tidak dapat dibedakan satu dari yang lain. Pengenceran bertingkat (serial dilution) menurunkan kepadatan itu secara terkendali sampai diperoleh cawan dengan jumlah koloni yang masuk rentang layak hitung.

Prinsipnya berjenjang dengan faktor tetap, umumnya sepuluh kali pada setiap tahap. Sebanyak 1 mL suspensi dari tabung pengenceran dipindahkan ke 9 mL pengencer steril, menghasilkan pengenceran 10⁻¹. Satu mililiter dari tabung tersebut dipindahkan lagi ke 9 mL pengencer berikutnya untuk memperoleh 10⁻², dan seterusnya. Pengencer yang lazim digunakan adalah larutan Buffered Peptone Water atau larutan garam fisiologis 0,85 persen, bukan air suling murni, sebab kejut osmotik pada air suling dapat melisiskan sebagian sel dan menurunkan hitungan.

Dua kebiasaan teknis menentukan ketelitian tahap ini. Setiap tabung dihomogenkan sebelum dipipet, karena sel yang mengendap membuat aliquot tidak mewakili suspensi. Pipet diganti pada setiap tingkat pengenceran, sebab sisa suspensi pekat yang menempel di dinding pipet akan terbawa dan membuat pengenceran berikutnya lebih pekat daripada yang tercatat.

Karena kepadatan awal sampel tidak diketahui, minimal dua sampai tiga tingkat pengenceran ditanam berdampingan. Cara ini memperbesar peluang setidaknya satu cawan jatuh pada rentang layak hitung.

Metode Tuang dan Metode Sebar

Ada dua cara menanam inokulum pada medium padat, dan keduanya memberi jenis koloni yang berbeda.

Pada metode tuang (pour plate), 1 mL inokulum dipipet ke dasar cawan petri steril, lalu medium agar cair bersuhu sekitar 45 °C dituang ke atasnya dan dihomogenkan dengan gerakan angka delapan. Sel terdistribusi di seluruh ketebalan agar, sehingga koloni tumbuh baik di permukaan maupun terbenam di dalam medium.

Koloni yang terbenam berukuran lebih kecil dan berbentuk lenticular, dan koloni semacam itu tetap dihitung. Kekeliruan yang sering terjadi adalah menghitung koloni permukaan saja karena koloni dalam agar kurang mencolok.

Pada metode sebar (spread plate), 0,1 mL inokulum diteteskan ke permukaan agar yang sudah memadat lalu diratakan dengan batang penyebar steril sampai cairan terserap. Semua koloni tumbuh di permukaan sehingga morfologinya lebih mudah diamati, tetapi volume inokulum yang lebih kecil menaikkan batas deteksi.

Aspek	Metode tuang	Metode sebar
Volume inokulum	1 mL	0,1 mL
Lokasi koloni	Permukaan dan dalam agar	Permukaan saja
Paparan panas pada sel	Ada, agar bersuhu ±45 °C	Tidak ada
Cocok untuk	Sampel tahan panas, populasi rendah	Mikrob sensitif panas, pengamatan morfologi
Batas deteksi tiap cawan	Lebih rendah	Lebih tinggi
Faktor volume pada perhitungan	1	10

Perbedaan volume itu berkonsekuensi langsung pada perhitungan. Menanam 0,1 mL berarti hanya sepersepuluh volume yang terwakili, sehingga hasil hitungan harus dikalikan sepuluh sebelum dikalikan faktor pengenceran. Kelalaian pada langkah ini menghasilkan laporan yang salah satu orde besaran.

Suhu agar pada metode tuang perlu dijaga. Agar yang terlalu panas mematikan sebagian sel dan menurunkan hitungan, sedangkan agar yang mulai memadat tidak lagi dapat dihomogenkan dengan inokulum. Rentang aman berada di sekitar 45 °C, dan inokulum sebaiknya tidak dibiarkan menunggu lebih dari tiga menit di dasar cawan sebelum agar dituang.

Rentang Koloni yang Dihitung Tidak Sama Antar Standar

Bagian ini paling sering disalahpahami, termasuk dalam banyak modul praktikum.

Cawan yang layak dihitung dibatasi dari dua arah. Bila koloni terlalu sedikit, ragam pengambilan cuplikan mendominasi hasil sehingga angkanya tidak stabil. Bila koloni terlalu banyak, koloni saling menghambat dan sebagian gagal tumbuh, sehingga hitungan justru meremehkan populasi sebenarnya. Karena itu setiap standar menetapkan rentang layak hitung. Masalahnya, angkanya berbeda antar lembaga.

Lembaga penetap	Rentang koloni per cawan
USDA dan AOAC	30 sampai 300
APHA	25 sampai 250
ISO 4833-1	15 sampai 300
FDA BAM Chapter 3	15 sampai 300

Yang menarik, FDA memperbarui rentangnya. Sebelumnya Bacteriological Analytical Manual memakai 25 sampai 250, kemudian diubah menjadi 15 sampai 300 dengan alasan yang dinyatakan terbuka dalam dokumen tersebut: ISO diterima luas dalam urusan regulasi, dan sebagian besar publikasi ilmiah memang menyajikan hasil dengan jumlah koloni rendah per cawan.

Implikasi praktisnya, angka 30 sampai 300 yang banyak beredar di modul praktikum Indonesia bukan satu-satunya rujukan yang sah, dan bukan pula rujukan termutakhir secara internasional. Bagi mahasiswa yang sedang menyusun laporan, urutan yang benar adalah mengikuti rentang yang ditetapkan protokol atau standar acuan praktikumnya, lalu menuliskan standar itu secara eksplisit dalam laporan. Menyebut rentang tanpa menyebut sumbernya membuat hasil tidak dapat dinilai orang lain.

Perlu dipisahkan juga dua hal yang sering tertukar: metode dan batas cemaran. ALT adalah metode enumerasinya. Berapa CFU yang masih boleh ada dalam suatu kategori pangan diatur terpisah, di Indonesia melalui SNI 7388 tentang batas maksimum cemaran mikroba dalam pangan serta peraturan BPOM untuk kategori tertentu. Angka batas tidak berasal dari metode, dan metode tidak menentukan lulus atau tidaknya suatu produk.

Prosedur Metode Tuang

1. Timbang 25 g sampel padat secara aseptik, masukkan ke 225 mL pengencer steril, lalu homogenkan. Nisbah ini menghasilkan pengenceran awal 10⁻¹. Untuk sampel cair, pipet 10 mL ke 90 mL pengencer.
2. Buat pengenceran berjenjang dengan memindahkan 1 mL ke 9 mL pengencer steril pada setiap tahap. Homogenkan setiap tabung dan ganti pipet pada setiap tingkat.
3. Pipet 1 mL dari sedikitnya tiga tingkat pengenceran ke dasar cawan petri steril, masing-masing secara duplo.
4. Tuang 12 sampai 15 mL Plate Count Agar bersuhu 45 ± 1 °C ke setiap cawan. Selang waktu antara pemipetan inokulum dan penuangan agar dijaga tidak lebih dari tiga menit.
5. Homogenkan dengan gerakan angka delapan atau memutar searah lalu berlawanan arah, tanpa melumurkan medium ke tutup cawan.
6. Biarkan memadat pada permukaan datar. Sertakan satu cawan kontrol berisi medium dan pengencer tanpa sampel untuk memastikan sterilitas keduanya.
7. Balik cawan yang sudah padat, lalu inkubasi 48 ± 2 jam pada suhu 35 °C. Pembalikan mencegah air kondensasi jatuh ke permukaan agar dan menggeser koloni.
8. Hitung koloni pada cawan yang jumlahnya masuk rentang layak hitung, dengan bantuan colony counter dan kaca pembesar. Koloni terbenam ikut dihitung.

Suhu dan waktu inkubasi mengikuti standar acuan yang dipakai. ISO 4833-1 menetapkan inkubasi pada 30 °C, sedangkan protokol FDA BAM menggunakan 35 °C. Perbedaan suhu inkubasi mengubah populasi mana yang terhitung, sehingga hasil dari dua suhu berbeda tidak dapat diperbandingkan langsung.

Perhitungan dan Contoh

Bentuk dasar perhitungannya:

CFU per mL atau per g = jumlah koloni ÷ (volume inokulum × faktor pengenceran)

Faktor pengenceran dituliskan sebagai kebalikan tingkat pengenceran. Cawan dari pengenceran 10⁻³ memiliki faktor pengenceran 10³.

Contoh 1, metode tuang. Dua cawan duplo dari pengenceran 10⁻³ masing-masing menumbuhkan 142 dan 156 koloni. Volume inokulum 1 mL.

Rata-rata koloni = (142 + 156) ÷ 2 = 149
CFU per gram = 149 × 10³ = 149.000, dilaporkan sebagai 1,5 × 10⁵ CFU/g

Contoh 2, metode sebar. Satu cawan dari pengenceran 10⁻⁴ menumbuhkan 68 koloni dengan volume inokulum 0,1 mL.

CFU per gram = 68 ÷ (0,1 × 10⁻⁴) = 68 × 10 × 10⁴ = 6,8 × 10⁶ CFU/g

Faktor sepuluh pada contoh kedua berasal dari volume 0,1 mL. Mengabaikannya menghasilkan angka sepersepuluh dari yang seharusnya.

Bila dua tingkat pengenceran berurutan sama-sama menghasilkan cawan yang layak hitung, standar ISO menggabungkan keduanya dengan pembobotan:

N = ΣC ÷ [(n₁ + 0,1 × n₂) × d]

dengan ΣC sebagai jumlah seluruh koloni pada cawan yang dihitung, n₁ jumlah cawan pada pengenceran terendah, n₂ jumlah cawan pada pengenceran berikutnya, dan d faktor pengenceran terendah yang dihitung.

Pembulatan dan Pelaporan Hasil

Ketelitian metode ini tidak sebanding dengan angka penuh hasil perkalian, sehingga hasil dibulatkan sebelum dilaporkan. Protokol FDA BAM menetapkan pelaporan hanya dua angka penting, dan pembulatan dilakukan pada saat konversi menjadi nilai akhir.

Aturannya: angka ketiga bernilai 6 sampai 9 membulatkan angka kedua ke atas, angka ketiga bernilai 1 sampai 4 membulatkan ke bawah, dan angka ketiga bernilai tepat 5 membulatkan ke atas bila angka kedua ganjil serta ke bawah bila angka kedua genap. Dengan aturan ini 14.500 menjadi 14.000, sedangkan 15.500 menjadi 16.000.

Kondisi cawan	Cara pelaporan
Jumlah koloni masuk rentang layak hitung	Laporkan hasil perhitungan, dua angka penting
Semua cawan di atas batas atas	Laporkan sebagai too numerous to count dan ulangi dengan pengenceran lebih tinggi
Semua cawan di bawah batas bawah	Laporkan angka hasil hitung, tandai sebagai estimasi
Tidak ada koloni pada semua pengenceran	Laporkan kurang dari 1 dikali pengenceran terendah yang dipakai, tandai sebagai estimasi
Cawan terkontaminasi atau tumbuh menyatu	Catat sebagai kecelakaan laboratorium, jangan dipaksakan menjadi angka

Hasil yang berasal dari cawan di luar rentang layak hitung tetap boleh dilaporkan, tetapi wajib ditandai sebagai estimasi. Menyembunyikan status itu membuat data terlihat lebih kuat daripada kenyataannya.

Koloni Menjalar dan Kasus Sulit

Koloni menjalar (spreader) tumbuh melebar sehingga menutupi area yang seharusnya ditempati koloni lain. Penanganannya bergantung pada polanya. Rantai koloni yang jelas terpisah dihitung sebagai koloni tersendiri satu per satu. Pertumbuhan menjalar yang membentuk koloni-koloni berbeda dihitung sebagai koloni biasa, lalu hasilnya digabungkan dengan hitungan koloni normal pada cawan yang sama.

Bila pertumbuhan menjalar menutupi lebih dari separuh cawan, atau bila lapisan pertumbuhan menyatu tanpa batas koloni yang dapat dibedakan, cawan tersebut tidak layak dihitung dan uji perlu diulang. Sumber tersering pertumbuhan semacam ini adalah permukaan agar yang masih lembap pada metode sebar dan kehadiran Bacillus atau Proteus dalam sampel.

Sumber Kesalahan yang Sering Terjadi

• Agar terlalu panas saat dituang. Sel sensitif panas mati sebelum sempat membelah, dan hitungan menjadi lebih rendah daripada populasi sebenarnya.
• Pipet tidak diganti antar tingkat pengenceran. Suspensi pekat yang menempel di dinding pipet membuat pengenceran berikutnya lebih pekat daripada yang tercatat.
• Tabung tidak dihomogenkan sebelum dipipet. Aliquot yang diambil tidak mewakili suspensi dan hasil antar duplo menjadi jauh berbeda.
• Koloni terbenam tidak dihitung pada metode tuang. Kesalahan ini sistematis dan selalu menurunkan hasil.
• Faktor volume 0,1 mL terlupakan pada metode sebar. Hasil menjadi sepersepuluh dari seharusnya.
• Air suling dipakai sebagai pengencer. Kejut osmotik melisiskan sebagian sel.
• Cawan tidak dibalik saat inkubasi. Air kondensasi menetes ke agar, koloni bergeser dan bergabung sehingga tampak lebih sedikit.
• Rentang layak hitung dipakai tanpa menyebut standar acuannya. Hasil tidak dapat diverifikasi pembaca lain.

Ringkasan Cepat

Butir	Keterangan
Yang diukur	Mikrob aerob mesofilik hidup yang mampu membentuk koloni
Satuan hasil	CFU/g atau CFU/mL
Medium lazim	Plate Count Agar
Volume agar, metode tuang	12 sampai 15 mL, suhu 45 ± 1 °C
Inkubasi	48 ± 2 jam pada 35 °C (FDA BAM) atau 30 °C (ISO 4833-1)
Rentang layak hitung	15 sampai 300 (ISO, FDA BAM), 25 sampai 250 (APHA), 30 sampai 300 (USDA, AOAC)
Pelaporan	Dua angka penting, hasil di luar rentang ditandai sebagai estimasi
Batas cemaran pangan	Diatur terpisah, bukan bagian dari metode

Pertanyaan yang Sering Muncul

Berapa jumlah koloni yang boleh dihitung dalam satu cawan?
Bergantung pada standar acuan. ISO 4833-1 dan protokol FDA BAM memakai 15 sampai 300 koloni per cawan, APHA memakai 25 sampai 250, sedangkan USDA dan AOAC memakai 30 sampai 300. Rentang yang dipakai perlu disebutkan bersama sumbernya.

Mengapa hasil dinyatakan dalam CFU dan bukan jumlah sel?
Karena satu koloni dapat tumbuh dari satu sel maupun dari sekelompok sel yang menempel. Metode ini menghitung unit yang mampu membentuk koloni, bukan sel individual.

Apa yang dilakukan bila seluruh cawan menumbuhkan koloni terlalu banyak?
Hasil dilaporkan sebagai too numerous to count dan pengujian diulang dengan tingkat pengenceran yang lebih tinggi.

Apakah ALT dapat mengidentifikasi bakteri penyebab kerusakan pangan?
Tidak. ALT hanya memberi perkiraan jumlah. Identifikasi memerlukan medium selektif, uji biokimia, atau metode molekuler.

Referensi

1. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, Chapter 3: Aerobic Plate Count. Edisi Januari 2026.
2. International Organization for Standardization. ISO 4833-1:2013, Microbiology of the food chain, Horizontal method for the enumeration of microorganisms, Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique.
3. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
4. Badan Standardisasi Nasional. SNI 7388:2009, Batas maksimum cemaran mikroba dalam pangan.
5. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis, sec. 977.27.