Kultur dan Pemanenan Sel Bakteri untuk Isolasi DNA Plasmid
Untuk mengisolasi plasmid bakteri, Anda harus mengkulturkan bakteri pada medium Luria Bertani (LB) yang mengandung nutrisi tinggi.
Koloni tunggal bakteri ditumbuhkan dalam medium LB (2-10 mL) dan diinkubasi pada shaker inkubator (150 rpm) suhu 37ºC semalaman.
Pastikan memperhatikan kepadatan pertumbuhan dan usia bakteri Anda.
Usia bakteri mempengaruhi rigiditas dinding sel dan keberhasilan proses lisis sel. Sebaiknya gunakan kultur overnight agar sel-sel bakteri ‘muda’.
Kepadatan jumlah sel bakteri pada kultur akan menentukan jumlah DNA plasmid yang diperoleh dari isolasi plasmid lisis alkali ini, terutama jika plasmid yang Anda inginkan memiliki copy number rendah.
Gunakan medium yang kaya nutrisi dan proses penggoyangan cepat agar sel-sel mendapat suplai nutrisi yang merata sehingga pertumbuhan sel baik dan padat.
Pemanenan Sel untuk Mengisolasi Plasmid
Panen sel dengan metode sentrifugasi pada kecepatan maksimum microfuge yang Anda miliki (10000rpm) selama 1 menit pada suhu 4ºC. Buang supernatan dengan perlahan menggunakan pipet.
Proses ini dapat diulang hingga 2 kali jika pelet yang didapat kurang banyak.
Sel bakteri bisa mengandung komponen yang menghambat kinerja enzim endonuklease. Jika Anda ingin mendigesti plasmid dengan enzim restriksi, cuci pelet sel yang didapat dengan larutan Sucrose Tris-EDTA (STE buffer).
Tambahkan 1 mL STE buffer dingin pada pelet dan disuspensi dengan memipet perlahan hingga seluruh pelet teresuspensi.
Lakukan sentrifugasi suspensi sel tersebut pada kecepatan maksimum microfuge (±10000rpm) selama 1 menit pada suhu 4ºC. Buang supernatan perlahan, gunakan pipet untuk membuang genangan supernatan di atas pelet yang masih tersisa.
Tahapan Isolasi Plasmid dengan Metode Lisis Alkali (Alkaline Lysis)
Metode isolasi DNA plasmid ini terdiri dari tiga tahapan utama, yaitu resuspensi pellet sel dengan buffer glucose Tris-Cl EDTA (GTE), lisis dengan larutan lisis SDS 1% dalam NaOH yang dinetralkan dengan larutan penetral potasium asetat, dan diakhiri dengan pemanenan DNA plasmid menggunakan presipitasi etanol.
Karena bahan-bahan yang digunakan berbahaya, disarankan menggunakan sarung tangan karet, jas lab, dan kacamata pelindung saat mengerjakan prosedur isolasi DNA plasmid ini.
Langkah dan rincian tiga tahapan utama adalah sebagai berikut:
Resuspensi dan Pengikatan Ion Mg2+ dan Ca2+
Resuspensi dilakukan dengan menambahkan 100 μL GTE (solution I/larutan A) dingin pada pelet hasil proses pencucian dan dicampur dengan pipetting beberapa kali hingga seluruh pelet teresuspensi. Gunakan Vortex jika diperlukan untuk memastikan sel telah merata.
Fungsi dari masing-masing komponen buffer GTE adalah sebagai berikut:
- Glukosa sebagai penjaga tekanan osmotik hingga sel tidak ‘meledak’ dan ‘menyemburkan’ DNA genom yang tidak diinginkan.
- Tris-Cl menjaga agar pH larutan tetap 8.0.
- EDTA merupakan agen pengkhelat yang dapat mengikat ion Mg2+ dan Ca2+, yang dibutuhkan untuk menjaga rigiditas dinding sel dan kinerja dari DNAse yang akan merusak hasil isolasi DNA plasmid.
Metode Lisis Alkali untuk Mengisolasi Plasmid
Sel dilisis dengan menambahkan 200 μL larutan lisis alkali (larutan B/solution II) yang dibuat dari NaOH 0,1 hingga 0,2 N yang telah dicampur 1% (b/v) SDS. Campuran di-invert perlahan sebanyak 10x.
Pastikan larutan B ini segar dan dibuat saat Anda akan memulai ekstraksi plasmid.
Kemudian, tambahkan 150 μL solution III (larutan C) dingin yang terdiri dari asam asetat glasial dan potasium asetat. Campuran diinvert perlahan beberapa kali sebelum didiamkan selama 3-5 menit di atas es.
Fungsi masing-masing komponen dari larutan ini adalah:
- SDS akan melarutkan membran sel bakteri hingga sel perlahan lisis dan ‘meledak’. SDS juga berfungsi merusak protein dan pengotor lain.
- NaOH juga merusak membran sel bakteri. Namun, peranan utama dari NaOH adalah merusak ikatan hidrogen dsDNA hingga molekul utas ganda tersebut memisah menjadi dua utas ssDNA.
- Potasium asetat berfungsi sebagai penurun pH hingga ssDNA dapat kembali menjadi dsDNA. Namun, dengan waktu inkubasi yang singkat, DNA plasmid akan menyatu lebih cepat dibandingkan DNA genom yang panjang.
DNA plasmid yang didapat dipanen dengan metode sentrifugasi pada kecepatan maksimum microfuge (±10000rpm) selama 4 menit pada suhu 4ºC. Transfer supernatant pada microtube baru.
Komponen sel yang berukuran besar seperti organel dan DNA genom akan mengendap (pelet) bersama SDS yang mengikat DNA genom dengan interaksi hidrofobik, sedangkan DNA plasmid yang cenderung ringan dan tidak terikat SDS akan tetap terlarut pada supernatant.
Pembersihan Senyawa Pengotor dengan Kloroform dan Fenol
DNA plasmid yang dihasilkan dari prosedur lisis alkali di atas masih mengandung banyak pengotor seperti garam-garam, komponen sel, dan protein-protein. Oleh karena itu, dilakukan pembersihan dengan menggunakan kloroform dan fenol.
Fenol akan
mendegradasi protein-protein dan komponen sel yang masih tersisa. Sedangkan kloroform akan mengikat fenol beserta protein dan komponen sel terdegradasi hingga terpisah dari plasmid yang diinginkan.
Langkah pembersihan ini dilakukan sebagai berikut:
- Pada tube berisi supernatant, tambahkan campuran 1:1 fenol dan kloroform sejumlah volume supernatant yang didapat.
- Jika tidak memiliki fenol, Anda dapat menggunakan kloroform.
- Campuran tersebut divortex secara perlahan beberapa detik dan disentrifus pada kecepatan maksimal selama 2 menit pada suhu 4ºC.
- Transfer lapisan terlarut air pada bagian atas kedalam microtube baru. Hindari lapisan non-polar pada bagian tengah dan bawah dari lapisan atas yang mengandung debris sel dan komponen lain yang tidak diinginkan.
Presipitasi DNA Plasmid dengan Ethanol
DNA tidak terlarut dalam pelarut non-polar seperti etanol dan isopropanol. Oleh karena itu, DNA akan mengendap saat ethanol atau isopropanol ditambahkan ke campuran ekstraksi plasmid.
DNA plasmid dalam supernatant diendapkan menggunakan ethanol absolut sebanyak dua kali volume supernatant yang didapat dari tahap pembersihan DNA plasmid menggunakan fenol:kloroform.
Misalnya, jika supernatant yang didapat memiliki volume ±150 μL, maka jumlah ethanol absolut yang ditambahkan juga sebanyak 300 μL. Jika Anda tidak memiliki ethanol absolut, Anda bisa menggunakan isopropanol.
- Setelah di-invert hingga nampak merata, diamkan microtube berisi campuran dalam freezer atau di atas es selama 30 menit.
- Setelah 30 menit, campuran disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal dan suhu 4ºC. Buang supernatan perlahan. DNA yang terpresipitasi dapat ditemukan dalam bentuk pelet putih yang sangat tipis.
- Setelah menghilangkan seluruh ethanol, tambahkan 1 mL ethanol 70% pada microtube berisi pelet DNA plasmid dan diinvert beberapa kali hingga merata.
- Campuran disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal dan suhu 4ºC. Buang supernatan perlahan. DNA yang terpresipitasi dapat ditemukan dalam bentuk pelet putih yang sangat tipis.
- Tambahkan 50 μL buffer TE yang telah ditambahkan RNAse A dan simpan pada suhu 4ºC.
- Anda dapat melakukan pengukuran dengan nanodrop atau melihat ukuran basa yang didapat dengan menggunakan elektroforesis.
Kesimpulan
Metode isolasi plasmid dengan metode alkaline lysis adalah teknik efektif untuk memperoleh DNA plasmid dari sel bakteri. Kultur overnight dengan medium LB yang kaya nutrisi dan penggoyangan yang cepat penting untuk hasil yang baik. Tahap resuspensi dan pengikatan ion Mg2+ dan Ca2+ memainkan peran penting dalam menjaga rigiditas dinding sel dan mencegah kerusakan DNA plasmid. Lisis alkali dengan NaOH dan SDS membantu melarutkan membran sel bakteri, memungkinkan DNA plasmid terlepas dari komponen sel lainnya.
Pembersihan menggunakan kloroform dan fenol membantu menghilangkan senyawa pengotor, seperti garam-garam dan protein. Terakhir, presipitasi DNA plasmid dengan ethanol menghasilkan DNA plasmid yang bersih dan siap digunakan untuk analisis lebih lanjut. Dengan mengikuti langkah-langkah yang tepat, metode ini menjadi pilihan yang efisien dan andal dalam penelitian bioteknologi dan ilmu genetika.